Johanna Mestorf war das vierte von neun Kindern des Arztes Jacob Heinrich Mestorf und seiner Ehefrau Anna Maria Sophia geb. Rosen. Der Vater widmete sich mit Leidenschaft der Altertumsforschung, was seine Tochter Johanna sicherlich beeinflusste. Er starb, als Johanna neun Jahre alt war. Die Mutter zog mit ihren Kindern - fünf lebten noch - nach Itzehoe. In Alter von 20 Jahren zog sie als Gesellschafterin und Erzieherin nach Schweden. Hier machte sie sich vertraut mit der Archäologie Germaniens und lernte nordische Sprachen. Wegen ihrer zarten Gesundheit musste sie Schweden nach einigen Jahren verlassen. Sie lebte zunächst als Begleiterin einer Gräfin in Italien und zog 1859 mit ihrer Mutter zu ihrem Bruder nach Hamburg. Hier beschäftigte sie sich vornehmlich mit Mythologie und Archäologie und übersetzte die archäologische Literatur Skandinaviens. Johanna Mestorf war Mitglied der Anthrophologischen Gesellschaft und später Gründerin seines schleswig-holsteinischen Zweigvereins. 1871 schickte sie der Hamburger Senat als seine Vertreterin zum Anthropologenkongress nach Bologna. Ihren Lebensunterhalt verdiente sie in dieser Zeit als Sekretärin für ausländische Korrespondenz bei der Hamburger Lithographischen Anstalt C. Adler. Johanna Mesdorf war reine Autodidaktin. Sie hätte auch keine Universität besuchen können, denn Frauen durften erst ab der Jahrhundertwende an deutschen Universitäten studieren. Johanna Mestorfs wissenschaftliches Ansehen war bereits zu Beginn der 1870er Jahre so bedeutend, dass sie 1873 Kustodin am Museum für vaterländische Altertümer in Kiel wurde. Nach dem Tod ihres Vorgesetzten 1891 wurde sie zur Direktorin des Museums ernannt. Im Alter von 71 Jahren erhielt sie als erste Frau in Preußen, den Titel "Professor". Johanna Mestorf übersetzte Arbeiten nordischer Archäologen und Anthropologen und lieferte zahlreiche eigene Arbeiten, von denen besonders diejenigen über Moorleichen, weit bekannt wurden. Und sie schrieb z. B. Werke über "Urnenfriedhöfe in Schleswig-Holstein". 1903, drei Monate vor ihrem Tod, trat sie von ihrem Amt als Direktorin des Museums zurück.